1.概要

工业上的蛋白质和化学药品的生物技术生产依赖于异养宿主细胞，该宿主细胞在诸如葡萄糖，蔗糖或甘油等原料中生长，这些原料在食品和动物饲料的生产中具有竞争性用途。Calvin–Benson–Bassham（CBB）循环是六个自然发生的CO2固定途径之一，其中包括核糖二磷酸（RuBP）羧化酶加氧酶（RuBisCO），这是生物圈中最丰富的酶并固定约90％的无机碳转化为生物质。当在阿拉伯糖上生长时，在大肠杆菌中表达编码RuBisCO和磷酸核糖激酶（PRK）的基因导致CO2释放减少。

2.研究过程与结果

巴斯德毕赤酵母（P.pastoris）被广泛用于生产生物制药和酶。这种工业酵母具有甲基营养型生活方式，并使用C1化合物甲醇作为唯一能源和碳源。甲醇被氧化成甲醛，然后进入异化或同化代谢分支。在同化分支中，甲醛被转化为生物质所需的磷酸糖，而在非同化分支中，甲醛被氧化为CO2，产生NADH。异化分支的步骤在过氧化物酶体和细胞质中进行，但是同化分支完全位于过氧化物酶体中。通过添加8个异源基因和3个天然基因的缺失，研究人员将巴斯德毕赤酵母的过氧化物酶体甲醇同化途径改造成类似于Calvin–Benson–Bassham循环的CO2固定途径。用C端过氧化物酶体靶向信号（PTS1）将CBB循环的6个基因定位到过氧化物酶体，通过与定位到细胞质的菌株相比，CBBp+RuBisCO菌株的优异生长行为证实，通过将CBB循环靶向过氧化物酶体从而取代天然的XuMP循环来分隔CBB循环是有益的。如预期的那样，阴性对照（CBBpΔRuBisCO）在含有甲醇和CO2的培养基上未生长。为了进一步确认DAS1和DAS2的缺失阻止了巴斯德毕赤酵母的甲醇同化能力，我们培养了两个对照菌株，一个在DAS基因中都缺失并且缺乏PRK和RuBisCO，而另一个则具有过氧化物酶体形式的TKL1。两个对照均未在甲醇上生长，这证实DAS1和DAS2的缺失足以阻止甲醇同化为生物质，并且异源Tkl1虽然具有序列相似性，但不能替代Das1和Das2。

在受控的生物反应器培养中测试了表达过氧化物酶体CBB循环的菌株（CBBp+RuBisCO）和具有破坏的CBB循环的阴性对照菌株（CBBpΔRuBisCO）的CO2掺入特性。在分批阶段将生物质积累在甘油上之后，向CBBp+RuBisCO和CBBpΔRuBisCO细胞中加入CO2和/或甲醇。因此，使用了两种不同的CO2进料方案：在方案A中，两种菌株中的一组首先仅进料甲醇，进料气中的CO2含量为0％（V/V），之后h，CO2增至5％（V/V）。在方案B中，首先向这两种菌株中的一组分别喂以甲醇和5％CO2，并在h后切换为0％CO2。对照菌株CBBpΔRuBisCO在任何这些条件下均未生长。这些结果表明，CBBp+RuBisCO菌株在作为碳源的二氧化碳上吸收并生长，因此具有功能性的二氧化碳同化途径。作为一种能源，甲醇可以被所有菌株氧化，但CBBpΔRuBisCO菌株中的氧化速率较低（不能利用二氧化碳导致甲醇利用效率变低）。CBBp+RuBisCO菌株仅在甲醇和CO2均存在下生长，并且仅在甲醇上延长时间后才能恢复在CO2上的生长。综上所述，这些数据表明在巴斯德毕赤酵母过氧化物酶体中表达异源CBB循环的工程菌株的生长取决于作为碳源的CO2的供应。

通过在含有完全标记的13C甘油作为唯一碳源的基本培养基上分批培养，对工程化细胞的生物质（CBBp+RuBisCO和CBBpΔRuBisCO）进行完全13C碳标记，CBBp+RuBisCO菌株生长，而CBBpΔRuBisCO菌株没有生长，但仍消耗甲醇。CBBp+RuBisCO菌株的生长伴随着生物质中13C含量的降低，h后，加有12CO2和13C甲醇的CBBp+RuBisCO的13C标记含量降低。在整个培养期间，未生长的CBBpΔRuBisCO在最终生物质中的13C标记含量没有变化。累积的生物量所需的所有碳均来自CO2。来自甲醇的碳被氧化成CO2，但是由于高气体流速，它被有效地从生物反应器中去除。因此，可以氧化甲醇但不能将CO2掺入生物质的阴性对照菌株（CBBpΔRuBisCO）在整个13C标记模式中没有显示出明显的变化。此外，关键代谢物中13C的快速转换显示了集成CBB循环的功能。综上所述，这些数据证实了具有功能性CBB循环的巴斯德毕赤酵母菌株利用CO2作为唯一碳源，而甲醇则作为能源。因此，该菌株的生活方式可描述为化学有机自养的。

该研究通过添加8个异源基因和3个天然基因的缺失，将巴斯德毕赤酵母的过氧化物酶体甲醇同化途径改造成类似于CBB循环的CO2固定途径。通过适应性实验室进化，生长速率进一步提高至0.h-1。这种工程化的巴斯德毕赤酵母菌株可以通过隔离温室气体CO2并避免食用有机原料以及在食品生产中的其他用途来提高可持续性。该研究已经证明了将异养菌转化为合成自养菌是可行的。代谢的重新设计导致二氧化碳作为唯一碳源。所得的酵母菌株可以用于从CO2生产大量化学物质和酶的系统的基础，并且可以减轻大气中的CO2。预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇

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